ระบบตรวจวินิจฉัย Covid-19, SHERLOCK, DETECTR

Updated: Apr 17, 2020


ภาพจาก https://blog.addgene.org/finding-nucleic-acids-with-sherlock-and-detectr

บทความ Covid-19, SHERLOCK, DETECTR
ที่มา Facebook Page: Biology Beyond Nature ชีววิทยาเหนือธรรมชาติ

1. สถานการณ์ระบาดรุนแรงของโรคไวรัสโคโรน่าสายพันธุ์ใหม่ (Covid-19) ทำให้ทีมวิจัยทั่วโลกเร่งมือคิดค้นวิธีการตรวจไวรัสที่ แม่น/ถูก/เร็ว/ง่าย เพื่อจะได้ใช้คัดกรองผู้ต้องสงสัยติดเชื้อได้ทีละมากๆอย่างทันท่วงที วิธีมาตรฐานที่ใช้กันอยู่ตอนนี้คือ real-time RT-PCR ซึ่งแม้จะแม่นยำ แต่ราคาตรวจอยู่ที่หลายพันบาทต่อครั้ง ใช้เวลาตรวจเป็นวัน และต้องใช้เครื่องมือพิเศษที่มีแต่ในโรงพยาบาลหรือห้องแล็บใหญ่ๆ

2. CRISPR diagnosis หรือการใช้ CRISPR/Cas สำหรับการตรวจวินิจฉัยโรคเป็นหนึ่งในเทคโนโลยีที่กำลังมาแรงในช่วง 3-4 ปีที่ผ่านมาก เทคโนโลยีนี้ถูกนำไปทำเป็นต้นแบบชุดตรวจโรคติดเชื้อไวรัสอย่างซิกา ไข้เลือดออก ผลการทดสอบเบื้องต้นพบว่าความแม่นยำใกล้เคียงกับ real-time RT-PCR แต่ค่าตรวจอาจจะลงมาอยู่แค่หลักร้อยบาท ใช้เวลาตรวจไม่ถึงชั่วโมง และไม่ต้องการเครื่องมืออะไรพิเศษ สามารถนำมาทำเป็น test strip คล้ายๆที่ตรวจครรภ์ จุ่มแล้วอ่านแถบสีก็รู้ผลเลย ดังนั้นตอนนี้ทีมวิจัยหลายทีมทั่วโลก (รวมถึงทีม VISTEC-ศิริราช ที่เพิ่งออกข่าวไป) ก็เลยลองพยายามประยุกต์เทคโนโลยีนี้มาใช้ตรวจ Covid-193. ระบบ CRISPR diagnosis ตอนนี้มีอยู่สองค่ายใหญ่ๆคือ SHERLOCK และ DETECTR ระบบ SHERLOCK คิดค้นโดยทีมวิจัยของ Feng Zhang จาก Broad Institute ของ MIT/Harvard ซึ่งต่อมาได้แบ่งทีมออกมาตั้งบริษัทสตาร์ทอัพชื่อ “SHERLOCK Biosciences” ส่วนระบบ DETECTR คิดค้นโดยทีมวิจัย Jennifer Doudna จาก University of California Berkeley ซึ่งก็มีบริษัทสตาร์ทอัพด้านการตรวจวินิจฉัยโรคเช่นกันชื่อว่า “Mammoth Biosciences” ชุดตรวจที่ทีม VISTEC-ศิริราช กำลังพัฒนาอยู่ใช้ระบ SHERLOCK และได้รับการสนับสนุนจากทีมของ Feng Zhang

4. ทั้ง Feng Zhang และ Jennifer Doudna ได้ขึ้นชื่อว่าเป็นผู้บุกเบิกเทคโนโลยี CRISPR/Cas genome editing ทั้งสองทีมวิจัยตีพิมพ์เผยแพร่ผลงานการใช้ CRISPR/Cas9 ในการปรับแต่งพันธุกรรมเซลล์มนุษย์แทบจะพร้อมกันในเดือนมกราคม 2013 โดยทีมของ Feng Zhang เฉือนเอาชนะตีพิมพ์ไปได้ก่อนประมาณสองสัปดาห์ ทั้งสองทีมนี้ต่างก็ได้ยื่นจดสิทธิบัตรเทคโนโลยีปรับแต่งจีโนมด้วย CRISPR/Cas9 ในนามของ Broad Institute และ University of California ซึ่งต่อมาก็กลายมาเป็นศึกชิงเจ้าสิทธิบัตรอันเลื่องลือระหว่างสองสถาบันนี้ (ใครสนใจไปอ่านเพิ่มเติมได้ที่: https://www.facebook.com/biologybeyondnature/posts/940399342789313:0 )>> ส่วนนี้เป็นหลักการ SHERLOCK vs DETECTR <<

>>> ข้ามไปข้อ 9 เลยถ้าจะดูแต่ผลตรวจ Covid-19 <<


5. พอ CRISPR/Cas9 เริ่มดังแล้ว หลายๆทีมวิจัยรวมทั้งทีมของ Feng Zhang และ Jennifer Doudna ก็เดินหน้าค้นหา CRISPR/Cas ตระกูลอื่นๆที่อาจจะเอาไปใช้ประโยชน์ได้ ทีมของ Feng Zhang ค้นพบ CRISPR/Cas ที่น่าสนใจอีกสองตัวคือ CRISPR/Cas12 และ CRISPR/Cas13


6. ทั้ง Cas9, Cas12 และ Cas13 ต่างก็เป็นเอนไซม์ ความแตกต่างก็คือ Cas9 และ Cas12 ตัดดีเอ็นเอสายคู่ ขณะที่ Cas13 ตัดอาร์เอนเอสายเดี่ยว ลำดับเบสที่เป็นเป้าหมายในการตัดของ ทั้ง Cas9, Cas12 และ Cas13 ไม่ได้ถูกกำหนดดัวยตัวเอนไซม์เองแต่ถูกกำหนดโดยอาร์เอนเอสายสั้นๆที่เรียกว่า guide RNA (gRNA) นั่นทำให้เราสามารถ “โปรแกรม” เอนไซม์พวกนี้ให้ไปตัดที่ลำดับเบสเป้าหมายอะไรก็ได้ที่เราต้องการเพียงแค่ออกแบบ gRNA ให้ตรงเป้าหมายนั้น ไม่ต้องยุ่งยากไปเปลี่ยนหรือวิศวกรรมเอนไซม์ใหม่ Cas12 กับ Cas13 มีคุณสมบัติพิเศษที่ Cas9 ไม่มีคือเมื่อเอนไซม์สองตัวนี้ถูก gRNA พาไปตัดเป้าหมายที่ถูกต้องแล้ว เอนไซม์จะเกิดอาการบ้าเลือดไปตัดดีเอ็นเอสายเดี่ยว (สำหรับ Cas12) หรืออาร์เอนเอสายเดี่ยว (สำหรับ Cas13) ที่อยู่ใกล้เคียงแบบสุ่มไม่จำเพาะลำดับเบส ปรากฏการณ์นี้เรียกว่า collateral cleavage ปรากฏการณ์นี้เป็นหัวใจสำคัญของระบบ CRISPR diagnosis ทั้งสองระบบที่ว่ามา


7. ทีมของ Feng Zhang ค้นพบ collateral cleavage ใน Cas13 ก่อน และได้นำเอนไซม์ตัวนี้มาประยุกต์สร้างระบบวินิจฉัยโรคที่เรียกว่า SHERLOCK (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing) หลักการทำงานของ SHERLOCK (ดูรูปประกอบทางซ้าย) เริ่มจากการเอาตัวอย่างจากผู้ป่วยต้องสงสัยมาเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมด้วยเทคนิค RPA (ถ้าเชื้อที่จะตรวจมีสารพันธุกรรมเป็น DNA) หรือ RT-RPA (ถ้าเชื้อที่จะตรวจมีสารพันธุกรรมเป็น DNA) ผลที่ได้คือสารพันธุกรรมของเชื้อ (ถ้ามี) ในรูปแบบดีเอ็นเอ จากนั้นก็นำดีเอ็นเอดังกล่าวมาถอดรหัสเป็นอาร์เอนเอด้วย T7 RNA polymerase ได้เป็น สารพันธุกรรมของเชื้อ (ถ้ามี) ในรูปแบบอาร์เอนเอ จากนั้นก็ใส่ของสามอย่างลงไปคือ Cas13, gRNA ที่เจาะจงต่อลำดับเบสเชื้อ และ reporter (ในรูปประกอบเป็นรูปดาวพ่วงอยู่กับวงกลมดำ) โดย reporter จะมีส่วนที่เป็นอาร์เอนเอสายเดี่ยวอยู่ด้วย (สายพ่วงดาวกับวงกลมดำในรูป) ถ้ามีอาร์เอนเอของเชื้ออยู่ในตัวอย่างจริง Cas13 จะโดนกระตุ้น เกิด collateral cleavage ไปตัด reporter ให้คุณสมบัติเปลี่ยนไป เช่น เรืองแสงออกมาหรือ เปลี่ยนความสามารถในการไปเกาะ test strip ให้เกิดเป็นแถบสีขึ้นมา


8. ทีมของ Jennifer Doudna ค้นพบ collateral cleavage ใน Cas12 จึงได้นำเอนไซม์ตัวนี้มาประยุกต์สร้างระบบวินิจฉัยโรคเช่นกันเรียกว่า DETECTR (DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter) หลักการทำงานของ DETECTR (ดูรูปประกอบทางขวา) คล้ายคลึงกับ SHERLOCK แต่ว่าไม่ต้องมีขั้นตอนการถอดรหัสด้วย T7 RNA polymerase เนื่องจาก Cas12 มีเป้าหมายการตัดเป็นดีเอ็นเอไม่ใช่อาร์เอนเออย่าง Cas13 ความต่างอีกอย่างคือ reporter ของ DETECTR มีสายพ่วงเป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยวแทนที่เป็นอาร์เอนเอ (ในรูปประกอบจะเห็นว่า DETECTR ต้องเริ่มจากตัวอย่างที่เป็นดีเอ็นเอ แต่จริงๆสามารถใช้กับตัวอย่างที่เป็นอาร์เอนอย่างเชื้อโคโรน่าได้ด้วยการ reverse transcribe กลับมาเป็นดีเอ็นเอก่อน)


9. ทั้งทีม SHERLOCK และ ทีม DETECTR ลุยงานสร้างชุดตรวจ Covid-19 ตั้งแต่โรคเริ่มระบาดใหม่ๆ ทั้งสองทีมได้เผยแพร่วิธีการผลิตชุดตรวจให้ทีมวิจัยอื่นๆทั่วโลกได้ไปลองทำตามบนเว็บไซต์ของ Broad Institute และของบริษัท Mammoth Biosciences นอกจากนี้ยังได้ส่งต้นฉบับผลการทดลองไปเผยแพร่บนฐานข้อมูลงานวิจัยก่อนตีพิมพ์อย่าง BioRxiv และ MedRxiv ทั้งสองทีมย้ำว่าชุดตรวจดังกล่าวยังไม่ได้ผ่านการรับรองจากองค์การอาหารและยา (FDA) ส่วนผลการทดลองก็ยังไม่ได้ผ่านการวิพากษ์ทบทวน (peer-review) โดยผู้เชี่ยวชาญภายนอก ดังนั้นโปรดอ่านและทดลองด้วยความระมัดระวัง


10. ทีม SHERLOCK ปล่อยรีพอร์ตผลการทดลองออกมาก่อนใน BioRxiv.org ตั้งแต่วันที่ 2 มีนาคม 2020 ในนั้นมีผลการทดสอบความไว (sensitivity) ของการตรวจอาร์เอนเอสังเคราะห์เลียนแบบเชื้อก่อโรค Covid-19 ด้วยชุดตรวจ SHERLOCK ที่รายงานผลด้วยการเรืองแสง (fluorescent reporter) หรือแถบสีบนกระดาษตรวจ (lateral flow) จากการทดลองสามซ้ำสรุปได้ว่าความไวในการตรวจอยู่ที่ประมาณ 10 cp/ul (~ไวรัสสิบตัวในสารละลายหนึ่งไมโครลิตร)ใกล้เคียงกับ real-time RT-PCR ซึ่งความไวอยู่ที่ประมาณ 3.5/ cp/ul แต่ใช้เวลาตรวจแค่ประมาณหนึ่งชั่วโมง ทีมวิจัยยังไม่ได้แสดงความจำเพาะเจาะจง (specificity) ของการตรวจว่าสามารถจำแนกเชื้อต่างๆได้ดีแค่ไหน และยังไม่ได้ทดสอบกับตัวอย่างจากผู้ป่วยจริง (ทั้งรีพอร์ตมีอยู่ figure เดียว) อย่างไรก็ตามประเด็นน่าสนใจคือทีมวิจัยได้กล่าวถึงการพัฒนาระบบ machine learning ที่เรียกว่า ADAPT สำหรับใช้ช่วยออกแบบระบบการตรวจ (เช่น การเลือกเป้าหมายของ CRISPR ที่เหมาะสมบนจีโนมเชื้อโรค) ให้ได้ความไวสูง เจาะจงสูง และครอบคลุมไวรัสที่อาจมีกลายกลายพันธุ์จนจีโนมหลากหลายได้ ทีมวิจัยเคลมว่า ADAPT ถูกเอาไปใช้กับการออกแบบชุดตรวจไวรัสหกสิบกว่าชนิด ซึ่งรวมไปถึงเชื้อก่อโรค Covid-19 และเชื้อใกล้เคียงด้วย ทีมวิจัยกล่าวว่ารายละเอียดเกี่ยวกับ ADAPT และผลการทดลองกำลังอยู่ระหว่างการเตรียมเขียนรายงานอยู่11. ทีม DETECTR ปล่อยรีพอร์ตผลการทดลองออกมาใน MedRxiv.org ในวันที่ 10 มีนาคม 2020 ในนั้นมีทั้งผลการทดสอบความไว (sensitivity), ความจำเพาะเจาะจง (specificity) และผลการทดสอบกับตัวอย่างจากผู้ป่วยจริง ความไวในการตรวจอยู่ที่ 10 cp/ul ใน 30-40 นาที และสามารถจำแนกความต่างระหว่างไวรัส SARS-CoV-2 (ซึ่งก่อโรค Covid-19 ในมนุษย์) เชื้อโคโรน่าตัวอื่นที่ใกล้เคียงกันอย่าง SARS-CoV ที่ก่อโรคหวัดในมนุษยหรือ bat-SL-CoVZC45 จากค้างคาวได้ การทดสอบในตัวอย่างอาร์เอนเอสกัด (nasopharyngeal swab, oropharyngeal swab) จากผู้ป่วย Covid-19, ผู้ป่วยไข้หวัดใหญ่, ผู้ป่วยไข้หวัดโคโรน่าธรรมดา และอาสาสมัครสุขภาพดี จำนวนรวม 21 ตัวอย่าง (มี Covid-19 10 ตัวอย่าง ไม่มี


11 ตัวอย่าง) พบว่า 90% ของตัวอย่างที่มีเชื้อ SARS-CoV-2 ให้ผลบวก ขณะที่ 100% ของตัวอย่างที่ไม่มีเชื้อ SARS-CoV-2 ให้ผลลบ


12. ความต่างหลักๆของชุดตรวจ Covid-19 ด้วย SHERLOCK และ DETECTR ถ้าดูจากแค่ผลการทดลองที่เผยแพร่แล้ว ณ ตอนนี้ได้แก่ a) SHERLOCK ใช้เทคนิค RPA ในการเพิ่มสารพันธุกรรมไวรัส ขณะที่ DETECTR ใช้เทคนิค LAMP (LAMP ใช้ primer เยอะกว่า ออกแบบยากกว่า ใช้อุณหภูมิสูงกว่า), b) SHERLOCK ใช้เวลาตรวจนานกว่าประมาณ 20-30 นาที เนื่องจาก SHERLOCK ต้องเปลี่ยนจีโนมอาร์เอนเอของไวรัสกลับมาเป็นดีเอ็นเอเพื่อเพิ่มจำนวนก่อนจะถอดรหัสกลับเป็นอาร์เอนเอให้เพื่อให้เอนไซม์ Cas13 ซึ่งเป็นหัวใจหลักของ SHERLOCK ทำงานได้ ขณะที่ DETECTR ใช้ Cas12 ซึ่งทำงานกับดีเอ็นเอโดยตรง เลยไม่ต้องเสียเวลาตอนถอดรหัส, c) ความไวในการตรวจถ้าดูจากรีพอร์ตล่าสุดจะพอๆกันอยู่ที่ 10 pc/ul แต่ถ้าดูก่อนหน้านี้ด้วย SHERLOCK เหมือนจะไวกว่าเพราะตรวจได้ที่ 10-100 pc/ul ขณะที่ DETECTR ได้ที่ 70-300 pc/ul, d) ตำแหน่งยีนเป้าหมายของไวรัสที่ใช้ในการตรวจตอนนี้ DETECTR ใช้ N gene และ E gene ซึ่งเป็นตัวเดียวกับที่ WHO และ CDC ใช้ใน real-time RT-PCR มาตรฐาน ขณะที่ SHERLOCK ตรวจ S gene และ Orf1ab gene, e) ชุดตรวจ DETECTR ใช้ยีน RNase P ของมนุษย์สำหรับเป็น + control ไว้เชคว่าชุดตรวจยังใช้การได้ ขณะที่ชุดตรวจ SHERLOCK ตามรายงานล่าสุดยังไม่มีตรงนี้


13. ข้อจำกัดสำคัญของทั้ง SHERLOCK และ DETECTR ตอนนี้คือต้องมีการสกัดอาร์เอนเอของไวรัสออกมาจากตัวอย่างที่จะทดสอบก่อนจะเอามาเปลี่ยนเป็นดีเอ็นเอแล้วเพิ่มปริมาณด้วย RPA หรือ LAMP ก่อนจะนำไปทำปฏิกริยากับ Cas13 หรือ Cas12 อีกที การสกัดอาร์เอนเอแม้ปัจจุบันจะมีชุดสกัดสำเร็จรูปแล้วแต่ขั้นตอนก็ยังถือว่ายุ่งยากกว่าที่คนทั่วไปจะทำได้ ดังนั้นก็ยังคงต้องใช้เจ้าหน้าที่ห้องแล็บทำอยู่ดี ยังไม่สามารถตรวจเองที่บ้านได้ทั้งหมดอย่างชุดตรวจครรภ์ ในรายงานของ Mammoth Biosciences บน MedRxiv มีตอนนึงพูดถึงการทดลองเอาตัวอย่างจากผู้ป่วยมาเปลี่ยนเป็นดีเอ็นเอแล้วทำ LAMP โดยตรง แม้จะพอตรวจได้แต่ความไวลดลงไปอยู่ระดับ 500-1500 cp/ul ถ้าเราสามารถหาวิธีข้ามขั้นตอนสกัดไปได้หรือถ้าให้ดีข้าม RPA หรือ LAMP ไปด้วยเลยก็น่าจะยิ่งทำให้ CRISPR diagnosis ไปได้ไกลกว่านี้อีก


14. สรุปแล้วชุดตรวจ CRISPR diagnosis สำหรับโรค Covid-19 ยังอยู่ในระหว่างการพัฒนา และยังไม่ได้มีการทดสอบในตัวอย่างจากผู้ป่วยจริงจำนวนมากพอที่จะยืนยันความไว ความแม่นยำ และโอกาสผิดพลาดต่างๆที่อาจจะเกิดขึ้น ตัวอย่างจากผู้ป่วยจริงมีความซับซ้อนยุ่งยากทั้งในเรื่องความไม่แน่นอนของปริมาณเชื้อไวรัส ความหลากหลายของพันธุกรรมไวรัสจากการกลายพันธุ์ หรือปัจจัยแทรกซ้อนจากการติดเชื้อตัวอื่นๆและสภาวะทางสรีวิทยาของผู้ป่วย SHERLOCK และ DETECTR น่าจะเป็นตัวแทนในสมรภูมิชิงความเป็นเลิศในวงการ CRISPR ระหว่าง Feng Zhang แห่ง Broad Institute และ Jennifer Doudner แห่ง UC Berkeley แต่ก็ยังเป็นเรื่องน่ายินดีที่ในยามวิกฤติ Covid-19 ระบาดทั้งสองทีมยอมปล่อยของ เปิดสูตร โชว์ผลการทดลองให้ทีมนักวิจัยทั้งหลายทั่วโลกได้เข้ามาช่วยกันต่อยอดสร้างเทคโนโลยีไปสู้กับหนึ่งในภัยพิบัติครั้งใหญ่ที่สุดของมวลมนุษยชาติคราวนี้Summary https://www.synthego.com/blog/crispr-coronavirus-detection https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28408723 (original SHERLOCK) https://science.sciencemag.org/content/360/6387/439 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29449511 (original DETECTR)https://blog.addgene.org/finding-nucleic-acids-with-sherloc… (comparison) https://www.cell.com/…/research-arc/infographics/CrisprVizI… https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4638220/ (Cas12a/Cfp1 discovery) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27256883 (Cas13 discovery)protocol https://www.broadinstitute.org/…/COVID-19%20detection%20(up… https://mammoth.bio/…/A-protocol-for-rapid-detection-of-the…SHERLOCK on bioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.26.967026v2 https://www.broadinstitute.org/…/enabling-coronavirus-detec…DETECTR medRxiv https://www.medrxiv.org/conte…/10.1101/2020.03.06.20032334v1


ที่มา Facebook Page: Biology Beyond Nature ชีววิทยาเหนือธรรมชาติ

0 views0 comments